首先，样品前处理流程的标准化和性能验证。由于mNGS检测需要尽可能覆盖所有病原微生物，因此样本前处理步骤需要同时考虑真菌、结核、隐球菌等难破壁的病原体，以及支原体、衣原体、病毒等相对易破壁的病原体。实际上，我们通常不能提前预知感染是由何种病原体引起的，那么针对这一挑战，可以按不同的临床情况来进行检验，如果临床判断为曲霉或者胞内细菌感染，可同时进行破壁法样品前处理和常规处理流程，分别构建两个文库进行病原体检测。这样可以很好解决难破壁和易破壁两大类病原微生物的检验，或者它们混合感染的检测。

第二，尽可能减少试剂和环境来源背景菌的存在和干扰，是mNGS技术面临的一大挑战。解决这个问题，最有效的办法是加入NTC（No Template Control，无模板的阴性对照），这可以为测序数据中背景菌的判读提供适当的参考。

第三个问题，真菌分类用的基因组数据库，和细菌、病毒数据库相比，可检测的物种较少，基因组数据中存在较多的污染序列、可作为参考的完整基因组数量有限。这个问题通过三代全基因组测序技术的普及，会有很大的改观。

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尽管宏基因组学具有潜力并取得了很大成功，但由于许多因素，临床诊断应用仍落后于研究进展，最新研究进展有哪些？

首先，宏基因组测序分析可用于菌株水平的鉴定和传播溯源。由于目前尚缺乏系统研究不同样本类型需要的测序数据量，国内共识建议采用20M数据量。在这个数据量的前提下，落到一些靶标病原的身上的数据量不足以满足基因组拼接，最近的研究方法采用构建好的标记基因数据库和测序片段比对的方式，实现了靶标病原的菌株鉴定和重构多个菌株的系统发育关系用于分子流行病学研究。

另外，在细菌分类用数据库方面，最新的研究方法采用基因组的完整度、污染性、平均核苷酸相似性等指标，对上百万的细菌基因组进行了性能验证，创建了一个新的细菌基因组分类学数据库，包括了127个门，四万多种细菌。其中不可培养细菌占比约四分之一。